EVO视讯细胞培养指南：

培养条件

使用气相条件为95%空气与5%二氧化碳，培养温度设定为37℃。

传代方法

第一次传代建议采用1:2的比例。建议在细胞培养的同时购买EVO视讯提供的完备培养基，享受优惠价格。收到细胞后，需进行处理，培养至良好状态后，将细胞瓶灌满完全培养液并封严瓶口，以确保细胞在运输过程中的最优状态。

细胞处理步骤

收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒操作后，放置于超净台内，确保无菌环境。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议使用40x、100x和200x各一张）。前三天的照片是售后服务的重要依据，如未提供照片，默认收到的状态良好。

细胞培养步骤

a. 贴壁细胞传代

1. 若细胞汇合度未超过80%，将培养液收集至离心管中，留下5ml完全培养基，并放入37℃、5% CO2孵箱中培养； 2. 若细胞密度超过80%，可开始传代。 3. 废弃培养上清，用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次； 4. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态； 5. 当细胞大部分变圆并脱落后，迅速移回操作台，轻轻敲击培养瓶，加入5ml以上的完全培养基终止消化； 6. 轻轻吹打细胞至完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，重悬添加1-2ml完全培养基； 7. 将细胞悬液按1:2比例分瓶，以新加完全培养基补至5-8ml/瓶，最后置于37℃、5% CO2培养箱中。

b. 悬浮细胞传代

1. 半换液法：竖立培养瓶在培养箱静置约1小时，轻轻吸除3ml培养基，补充3ml完全培养基； 2. 如果培养基变色较慢，可直接加入约500ul FBS，传代时可直接补充5ml培养基，分至两个新培养瓶中，一般经过3次传代后可进行离心传代以去除死细胞； 3. 离心换液法：将细胞悬液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清，重悬加入1-2ml培养液，分至新的T25瓶中，添加6-8ml按照说明书配置的新完全培养基，以保持细胞生长活力。后续传代将根据实际情况按1:2至1:5比例进行。

细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶的80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次； 2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞状态，细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化； 3. 将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟； 4. 弃去上清，加入1ml的EVO视讯无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管； 5. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中。如后续需转入液氮罐，需先在-80℃冰箱存放超过24小时再转入液氮罐中。

细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（佩戴防护面具），快速放入37℃水浴解冻，直至无结晶后用75%酒精消毒外壁； 2. 将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟； 3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中； 4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

部分细胞可能在运输过程中发生脱落，这是正常现象。如细胞脱离较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。沉淀细胞后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，再进行离心，重悬并按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），添加新完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。