糖蛋白在人体内占蛋白质的50%以上，是许多生物药物的重要组成部分。作为一种最常见的翻译后修饰（PTM），蛋白质糖基化对调节多种生物过程至关重要。糖蛋白的一级序列分析，包括糖基化位点的确认及其相关糖链结构，是研究糖蛋白功能的基础。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为蛋白质鉴定及翻译后修饰探索的重要工具。与传统的数据库搜索策略不同，从头测序提供了一种全新的研究方式，无需先验的DNA或氨基酸序列基础。然其复杂的多糖基化位点，常常导致序列覆盖不足以及游离寡糖修饰谱的不明确，给从头测序的信息获取带来了挑战。因此，在具有一致结构及已知N-连接糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中，广泛的糖基化通常形成缺口，限制了从头测序的应用。

2025年，发表在JACSAu (IF 86) 上的研究“Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy”介绍了一种基于质谱的新方法来识别未知糖蛋白。这一方法将糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征相结合。通过N-/O-糖的去糖基化，研究者实现了全面的序列覆盖，并配合EThcD碎裂技术得以生成高质量长肽，进而推动了精确的蛋白质组装。研究者将此方法应用于复杂的糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种未知序列的肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了其一级序列间的细微差异。同时，在亚基、糖肽及聚糖层面进一步表征了这些蛋白质的N和O糖基化修饰。此策略有效连接了从头测序与糖基化修饰之间的空白，提供了关于糖蛋白一级结构及其修饰的全面信息，成为糖蛋白精准测序的可靠方案，应用于基础研究和生物制药行业中的价值显而易见。

研究方法包括：首先，使用N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶，以确保去糖基化的效果。通过完整质量分析确认去糖基化成功, 利用EThcD碎裂技术获取高质量肽段并采用PEAKSAB进行序列分析；其次，在含有18O的环境中采用PNGase F酶解将糖基化的天冬氨酸转换为标记有18O的天冬氨酸，以定量分析N糖基化位点；最后，通过内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，并使用pFind分析质谱数据，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

在这项研究中，作者提出了一种基于综合质谱的方法用于从头解码糖蛋白的糖基化。研究团队采用了含唾液酸化的N聚糖和O聚糖的常用模型糖蛋白Fetuin-A，开发了糖蛋白的从头测序策略。通过糖苷酶水解糖苷键，简化质谱分析及肽序列，从而获得去糖基化蛋白的一级序列。接下来，使用糖基化高度复杂的生物制药依那西普验证该方法的有效性，并揭示三种未知TNFR:Fc融合生物制剂的氨基酸序列，探讨与原研药物依那西普的相似性，进行全面的糖基化表征。

为确保N和O-糖基化的准确性，作者进行了多层次分析，包括N-糖基化位点的确认、游离寡糖分析及糖蛋白亚基以及糖肽分析。通过PNGase F催化，特异为连接的天冬氨酸标记18O，并计算肽强度，从而实现对N-糖基化位点的量化检测。此外，采用内切糖苷酶混合物部分裂解N-糖，产生GlcNAc/GlcNAc-Fuc的修饰谱图，进一步确认N-糖基化位点的鉴定结果。

为了在整体蛋白质层面上确定N-糖的含量和结构，团队以2-AB标记对酶促释放的N-糖进行衍生化，并通过UPLC-HILIC-FLR-MS进行分析。结果显示，依那西普释放的最丰富N-糖类型为F(6)G2F，其次为F(6)G0F和G2，而三种TNFR:Fc生物制剂的结果与依那西普相似。此外，作者还评估了去除O-糖后，在亚基层面N-糖变体的存在情况。通过质谱技术，准确定位了糖基化位点的特异性差异，为未来的生物药物研发提供了数据支持。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序技术为揭示氨基酸序列提供了强有力的工具。结合糖苷酶酶解及EThcD碎裂，这一新策略为深入了解高度糖基化蛋白质开辟了新天地。这项工作不仅提供详尽的信息，解析氨基酸序列及糖基化位点，还揭示了糖型异质性的复杂性。鉴于在CHO细胞系中表达的N-/O-glycosylation的普遍性，该研究为成功分析各种生物制药建立了重要框架，助力于治疗多种疾病。

在此背景下，值得关注的是EVO视讯在生物医疗领域中的应用。期待EVO视讯能够通过先进技术，进一步推动生物制药的创新与发展，提供更有效的治疗方案。